2.実験方法
2−1 呼吸活性測定装置
2−1−1 準備
1）菌の培養
微生物固定化膜を作製するための微生物として、Bacillus subtilisを用いた。804培地(原核微生物用の培地，組成 Yeast extract 0.5% Polypepton 0.5% Glucose 0.5% MgSO4･7 H2O 0.1% Agar《寒天培地用》2.0%)を、1N H2SO4溶液および1N NaOH溶液で、pH7.0に調整した。その後、高圧蒸気滅菌処理(オートクレービング)をした(121℃, 2atm, 15min)。
斜面培地でリフレッシュした微生物を一白金耳量、坂口フラスコ内の50ml液体培地に植菌した。それを30℃で24時間振とう培養(100Hz)した。
2) 緩衝液および試料の調製
呼吸活性測定装置に流し込むリン酸緩衝液および銀イオン水溶液，グルコース水溶液を次のように作製した。
0.02Mリン酸緩衝液(組成：KH2PO4 1.36g/l Na2HPO4 ･12H2O 3.58g/l)はKH2PO4を用いて、ｐH7.0に調整した。0.1Mをまずつくり、5倍希釈して0.02Mとした。
銀イオン溶液はAg2SO4(和光純薬株式会社＝製造／試薬特級)を使用して、まず1.0mMAg+溶液を作製した。その1mM溶液をもとにして、各濃度のAg+溶液を作製した (20μM, 40μM, 100μM) 。
グルコース溶液は D (+)−Glucose(和光純薬株式会社＝製造／試薬特級)を使用して、2mM,1mM, 0.5mM, 0.25mMを作製した。
また、すべての試薬の調整および呼吸活性測定装置に流し込むD.W.として、蒸留水を用いた。
2−1−2 微生物固定化膜の作製
微生物培養液を蒸留水で25倍希釈し、吸光度(620nm)を測定、次式により固定化に供する培養液量を算出した。
X=0.11／ABS X；固定化に供する培養液量（ml）
ABS；25倍希釈培養液の吸光度
Fig.4のように、両面テープ(ニチバンナイスタックラベルNW−20)でビニールパッチ(ニチバンマイタックラベルML−250，外径14.5mm×内径6mm)を貼り付けた多孔性アセチルセルロース膜(日本ミリポア・リミテッド社＝製造 Filter type；HA，Pore size；0.45μm 直径1.4cm)を、アスピレーターで吸引し、その上(ビニールパッチの内径6mm)に上式で算出した量の培養液を滴下した。培地成分がアセチルセルロース膜をすり抜けることにより、菌体のみを膜に付着(吸着，固定)させた。さらに、その上から多孔性アセチルセルコース膜を貼り付け、菌体固定化面を密封した。作成した微生物固定化膜は、蒸留水中で冷蔵(約5℃)保存した。
固定化膜は、測定を行った際に安定した応答がでるように、作成後一週間保存(約5℃)して、菌を飢餓状態にしてから使用した。または、固定化膜を緩衝液に入れ、24〜36時間を目安に曝気(バブリング)を行ってから使用した。
→
Fig.4 微生物固定化膜の作製の手順
2−1−3 呼吸活性測定装置の作動方法
Fig.5に呼吸活性測定装置の構成を示した。微生物電極を恒温槽中に設置し、サーモミンダー(タイテックSM−5)で30℃に維持した。ペリスターポンプ(GILSON Minipuls2)により、試料および緩衝液をそれぞれ0.5ml/分の速度で、フローセルに流した。試料の種類をコンピュータにより制御した。オートサンプラー(KYUWASEMITSU,CO.LTD)によって、任意の試料を一定時間おき(例；試料７分，蒸留水３３分)に流すようにした(Table 1参照)。緩衝液および試料と共に、エアーポンプで空気を送り込み、微生物電極のフローセル内を酸素飽和状態に保ち、空気の流れる勢いでフローセル内の撹拌も行うようにした。
測定条件の試料流入時間やグルコース溶液および銀イオン溶液の濃度を、様々にかえて測定を行った。微生物電極の応答電流と測定条件等のデータは、コンピュータにより記録,処理した。
Fig.5 呼吸活性測定装置の構成
Table 1オートサンプラーの流路番号に対応する試料
流路番号
１
2
3
4
5
6
7
8
添加試料
試料
蒸留水
試料
蒸留水
試料
蒸留水
試料
蒸留水
１サイクル
←１ターン→
←１ターン→
←１ターン→
←１ターン→
説明）今回用いたオートサンプラーは一定時間ごとに最高8種類の試料を添加することができる。表中の流路番号とは任意の試料流入経路に番号をつけたものである。また、流路番号1〜2，3〜4，5〜6，7〜8，をそれぞれ1ターンと呼び、4ターン＝1サイクルとした。
２−1−４データの見方
Fig.6に微生物の呼吸活性に対応する電極応答のグラフを示した。例えば、微生物電極のフローセル内に試料としてグルコース溶液が流入すると、固定化膜内の微生物がグルコース(呼吸基質)を取り込むのに伴い、酸素を消費する。その時、酸素電極に到達する酸素量が微生物に消費された分だけ少なくなる。その結果、電流値は低下する。すなわち、これは微生物の呼吸が活性化した(または酸素の消費が増加した)ことを意味する。また、グルコースが流入していないときでも常に一定の酸素消費がされている。
Fig.6 微生物の呼吸活性に対応する電極応答のグラフ
2−2ペーパーディスク法による検定試験各種微生物の銀イオン耐性能力を比較するために、ペーパーディスク法を用いた。供試菌として､Bacillus subtilis , Pseudomonas putida , Alcaligenes faecalis, Escherichia coli , Tricosporon cutaneum , Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastorisを用い、次の手順で試験を行った。
１） ぺーパーディスク(直径1.0cm)に各種濃度の銀イオン(1〜20ｍM)を0.1mlずつ染み込ませ、24〜36時間、暗所で乾燥させた。
２） 培養は、804培地(6ページ参照)とYMG培地(真核微生物用，組成 Yeast
extract 0.3%, Polypepton 0.3%, Malt extract 0.3%, Glucose 1.0%, Agar《寒天培地用》 2.0%)を用い、1N H2SO4溶液および1N NaOH溶液で、pH7.0に調整した。その後、高圧蒸気滅菌処理(オートクレービング)をした(121℃, 2atm, 15min)。
３) 各種微生物の菌液を作製した。斜面培地でリフレッシュした菌体を一白金耳量、坂口フラスコ内の50ml液体培地に植菌後、原核微生物は２４時間，真核微生物は４８時間、30℃で振とう培養(100Hz)した。
４) ２５倍希釈した各種菌液を平板培地に200μl塗抹し、その上に銀イオンを添加したペーパーディスクを乗せ、原核微生物は２４時間，真核微生物は４８時間、30℃の暗所で培養した。
５）培養後、ペーパーディスクの周囲に、Fig.7のように出現した阻止円の直径を測定した。
Fig.7 ペーパーディスク法により阻止円が出現した様子
２−3 銀イオンの最少生育阻止濃度の試験
銀イオンの最少生育阻止濃度を調べるため、次の培養試験を行った。供試菌および培地は｢２−2 ペーパーディスク法｣(11ページ)と同じものを用い、以下の手順で実験を行った。
１） 培養器として、ワッセルマン氏試験管を用い、培地量を3ｍｌに統一した。
２） 培地へ1.0mMAg+溶液を適量添加して、銀イオン濃度を調整した。
３） 真核微生物は斜面培養した菌体を一白金耳量接種した。原核微生物は斜面培養した菌体を一白金耳量接種、または液体培養した菌液を50μl接種して、試験を行った。
４） 30℃で5日間、振とう培養(100Hz)した後、銀イオン添加培地(２５倍希釈)のO.D.値が、0.010以下であった場合、最少生育阻止濃度とした。また、阻止濃度は基本的に0, 20, 40, 60μMのように20μMおきに測定した(一部、10μMおきに測定した)。
2−4 紫外線照射突然変異誘起法
紫外線の作用により突然変異を誘起し、銀イオン耐性変異株を取得するため、次の試験を行った。供試菌として、B.subtilisおよびP.putidaを用い、以下の手順で実験を行った。
１） 前処理
８０４液体培地で２４時間､30℃で振とう培養(100Hz)した。培養した菌液をエッペンドルフ式チューブに1.0ml、採った。エッペンチューブ内の菌液を12000ｒｐｍで2分間遠心分離し、菌体を沈殿させ、上清の培地成分を除去した。そこに、10mMリン酸緩衝液を1.0ml添加して、懸濁し、菌体を洗浄した。さらに12000ｒｐｍで2分間遠心分離し、菌体を沈殿させ、上清を除去した。その菌体洗浄操作を2回繰り返した。洗浄後の菌体を20ｍｌの10mMリン酸緩衝液に懸濁し、滅菌シャーレに移した。
２） 紫外線照射
菌懸濁液の入った滅菌シャーレのふたを取り、30cm上方から254nm紫外線を3分間照射した(殺菌率約99％)。
３）突然変異の誘起
紫外線照射した菌懸濁液を5ml採り、45ml 804液体培地に接種した。そして、暗所で、２４時間､30℃で振とう培養(100Hz)した。
５） 耐性菌の分離
培養条件は｢2−3 銀イオンの最少生育阻止濃度の試験｣(12ページ)と同様にした。銀イオン添加培地の銀イオン濃度の次第に濃い培地に耐性菌を継代する、多段階選択法を用いた。
