４．考察
＜銀イオン存在下におけるB.subtilisの呼吸活性測定＞
Fig. 10とFig.11において、銀イオン添加時に、呼吸活性の緩やかな上昇がみられた。このことは銀イオン存在下において、何らかの理由でエネルギーが消費されたことを示す。おそらく、細胞膜の能動輸送(イオンポンプ)により、毒性のある銀イオンを排出するときにエネルギーが消費された(６ページ参照)ことが考えられる。しかし、Fig. 12においては、銀イオン添加時に呼吸活性の上昇はほとんどみられなかった。また、Fig.10においても、微生物膜の内性呼吸が低下するにつれて、銀イオン添加時の呼吸活性の上昇もみられなくなりつつあった。文献によれば、重金属イオンは膜輸送に関与するN/K−ATPアーゼの酵素活性を阻害するらしい。よって、それと類似の作用により、膜輸送が阻害され、そのイオンポンプにともなう呼吸活性の増加がみられなくなったことが考えられる。もしくは、銀イオンを毒物と認識し、選択的に膜輸送タンパクにより取り込まなくなったことも考えられる。
＜ペーパーディスク法および銀イオン最少生育阻止濃度測定＞
ペーパーディスク法による銀イオン耐性能力の比較データと銀イオン最少生育阻止濃度の結果を比べると、各種供試菌の耐性能力の強さの順位に相違がみられた。これは、最少生育阻止濃度測定は比較的純粋に微生物の銀イオン耐性能力のみを測定できるのに対して、ペーパーディスク法は微生物の増殖速度の相違が、結果に影響するためと考えられる。
＜紫外線照射突然変異誘起法による銀イオン耐性変異株の取得＞
P.putida銀イオン耐性変異株の銀イオン添加培地における生育状態より、200μM銀イオン存在下で生育可能であり、比較的増殖速度の速いものと、300μMで生育可能であり、比較的増殖速度の遅いものの、2種類存在しているように、思われた(19ページの｢観察データ｣を参照)。また、コロニーの外観を比較しても、若干の相違がみられた。よって、銀イオン耐性変異株は2種類分離されたものと考えられる。
また、この度分離された銀イオン耐性株は親株と様々な点で性質に相違がある。よって、同定試験を行わない限り、本当にP.putida変異株なのか、または全く別のコンタミネーションした菌なのか、証明することはできない。よって、菌種の同定が必要である。
【結論】
１) B.subtilisは、20μM銀イオン存在下において、少なくとも呼吸活性が上
昇する時(p14，Fig.10とp15，Fig.11参照)としない時(p16，Fig.12参照)があることが分かった。その理由として、前者の場合には毒性のある銀イオンを排出するときに呼吸活性が増加すると考えられる。後者の場合には、銀イオンの毒作用により膜輸送に特異的に働く酵素の活性が低下すると、呼吸活性が増加しないことが考えられる。また、銀イオンを毒物と認識し選択的に取り込まなくなることも考えられる。
２) ペーパーディスク法による各種微生物の銀イオン耐性試験結果は、B.subtilis＞P.putida＞E.coli＞T.cutaneum ＞A.faecalis＞S.cerevisiae＞P.pastorisの順となった。それに対し、最少生育阻止濃度測定法による銀イオン耐性は、E.coli≧B.subtilis≧A.faecalis＞T.cutaneum＝S.cerevisiae＞P.pastoris ＞P.putidaの順となった。
耐性能力の強さの順位に相違がみられた。これは、最少生育阻止濃度測定法は、銀イオン濃度が一定で、阻止濃度をこえると生育を阻害するのに対し、ペーパーディスク法は、銀イオン濃度はペーパーからの拡散とともに経時的に増加する。それが生育阻止濃度に達するまで微生物は増殖する。すなわち、拡散と増殖速度の関係に依存する。
３) 紫外線照射突然変異誘起法により銀イオン耐性変異株が取得された。また、その銀イオン最少生育阻止濃度の変化は、P.putida野生株20μMから、P.putida変異株340μMとなった。また、B.subtilisの耐性変異株は取得できなかった。
【今後の課題】
１) 分離された銀イオン耐性変異株の菌種の同定が必要である。
２) 銀イオン耐性変異株が他の重金属にも耐性を示すかどうかを測定する。
３) 銀イオン耐性変異株の耐性要因の究明が必要である。例えば、銀イオン存
在下において発現する遺伝子や蛋白質を調べるために、SDSページ法を用いたり、RNAを逆転写させて、cDNAをつくりそれを電気泳動し、発現する遺伝配列を特定するなどの方法がある。
５．参考文献
｢重金属と生物｣ 1988年11月10日＝初版
株式会社博友会＝発行
茅野 充男／斎藤 寛＝共編
｢生命と金属｣ 1991年8月5日＝初版
共立出版＝発行 落合 栄一郎＝著
＊ 特に、100〜105ページ参照。
｢生体と重金属｣ 1981年1月20日＝初版
講談社＝発行 講談社サイエンティフィク＝編集
不破 敬一郎＝編著
｢生命の無機化学｣ 1984年3月1日＝初版
廣川書店＝発行 松島 美一／高島 良正＝共著
｢金属イオンの生物活性｣ 1982年5月20日＝初版
化学同人＝発行
美谷 美徳／田中 久／中原 昭次＝共編