1. 緒論
1−1 緒言
近年、工業排水中に含まれる、重金属イオンによる水質汚染が問題になってきた。20世紀には、有機水銀やカドミウム、銅などによる公害事件が、実際に問題になった｡ 21世紀の今日、汚水処理の徹底および技術的な発展により、以前のような大規模な公害事件は起きていないが、微量重金属による環境汚染はいまなお続いている。その改善方法のひとつとして、微生物を用いた工業排水および自然水から重金属を回収する技術が注目されている。今回、その基礎的研究として、紫外線照射突然変異誘起法による銀イオン耐性微生物の取得を試みた。この方法は他の重金属に対する耐性微生物も同様に取得できる可能性がある。
銀は、写真の感光材料や装飾品として多量に消費されている。また、最近は抗菌剤として、多量に利用されつつある。例えば、切花産業において、カーネーションの日持ちをよくするために、チオ硫酸銀処理が行われている。その使用量はオランダだけで年１００キログラムになるといわれている。また、プラスチックに銀イオンを練り込み、抗菌処理を施した製品が普及している。汚水処理の徹底により、銀イオンによる公害問題は発生していないが、銀イオン耐性微生物を用いて、新しい回収技術を開発できる可能性がある。
また、微生物の銀イオン耐性について、銀イオン存在下における呼吸活性に着目し、酸素電極を用いた測定を行った。微生物の重金属耐性機構には、大きく分けて二種類あるといわれている。ひとつは、細胞膜の能動輸送(イオンポンプ)による重金属イオンの排出である。もうひとつは、メタロチオネインと呼ばれるタンパク質による重金属の吸着，無毒化である。微生物が銀イオンを排出する場合、なんらかの形(例えば、ATPなど)でエネルギーが消費、それと同時に呼吸活性が増加する可能性がある。特に、好気呼吸の場合は呼吸基質と共に、酸素が消費される。これを電気的に測定する。 また、各種微生物の銀イオン耐性能力をペーパーディスク法と最少生育阻止濃度測定法を用いて測定，比較した。
1‐２微生物電極の原理
本実験では、カルバニ方式の酸素電極上に生存状態の好気性微生物を固定化した膜(微生物固定化膜)を装着することで、微生物電極を構成した(Fig.1参照)。
酸素電極はアノード，カソード，電解液(KCl)，およびカソードに密着した酸素透過性高分子膜(テフロン膜)から構成されている。測定液中の酸素はまず、微生物固定化膜内で一部消費された後、酸素透過性高分子膜(テフロン膜)に達する。そして、酸素透過性高分子膜中を拡散し、カソード表面に達する。この酸素分子は、カソードで電気化学的に還元される。今回用いたカルバニ方式の特徴は、電解質溶液中の異なる金属(アノード及びカソード)間に生じる電位差(カルバニ電位差)を利用して、カソードで酸素の還元を行う方式であり、外部電力を必要としない。
以上の原理で、挿入した試料液中の酸素濃度が高いと電流値が上がり、酸素濃度が低いと電流値が下がる。この性質を利用して、電極に装着した膜中の好気性微生物の呼吸活性(酸素消費量)を測定するものである。
Fig.1 微生物電極の模式図
1−3 紫外線照射突然変異誘起法
微生物に紫外線を照射すると、遺伝子の部分的な異常が誘発される。紫外線照射突然変異誘起法とはその原理を利用して、人工突然変異を誘発する方法のひとつである。本実験では、この方法により銀イオン耐性微生物の取得を試みた。
その原理は、紫外線の作用により、遺伝子の塩基配列のチミンモノマー(一量体)が隣同士に連続している部分が化学変化を起こして、チミンダイマー(二量体)になることに起因する。チミンダイマーが出現することにより、遺伝配列の一部が異常になり、正常な遺伝子の複製や発現を妨げる原因になる。自然環境においても頻繁にチミンダイマーは出現するが、通常、光回復や除去修復によって、そのほとんどが修復される。しかし、まれに修復ミスにより、通常とは異なる塩基配列に置き換わることがある。その変換された塩基配列がセンス配列だった場合、生体に形態的、または機能的な突然変異が起こる。人為的に紫外線を照射することにより、チミンダイマーの大量出現にともなう塩基配列の変換(修復ミス)を高確率に起こすことが可能である。
また、薬剤耐性などの抵抗性変異株を分離する方法は、その生育阻害剤を一定濃度添加した培地で生育した変異株をコロニーアイソレーションする方法が主流である。また、薬剤耐性変異株などをその薬剤濃度を次第に上げた培地に継代する多段階選択法はより有効である。アナログ耐性変異株などは、この薬剤耐性株の取得法で採取できる。本実験ではその多段階選択法を用いた。
1−4 重金属イオンの毒性および微生物の耐性能力
マグネシウム，銅，鉄などの金属イオン(ミネラル)は、生物の生存に絶対必要な、必須元素である。おもにそれらの金属イオンは酵素タンパク質と結合し、酵素の活性化因子として働く。それに対し、銀，水銀，カドミウムなどの重金属イオンは生体に対し強い毒性を持つ。その重金属が毒性を持つ理由は、直接生体のタンパク質と結合し、変性，失活させる作用を持つためである。また、重金属類はPb2+を除いて、概してルイス酸性が強いため、タンパク質や酵素に含まれている正常な金属を追い出して、その代わりに入り込む傾向がある。酵素などのタンパク質がつくられる過程で、正常な金属イオン(ミネラル)の代わりに重金属イオンが取り込まれ、タンパク質が失活することもある。(→Fig.2)
微生物は一般に、重金属イオン耐性形質を持っているといわれる。そのひとつは、細胞膜のイオンポンプによる排出機構である。もうひとつは、メタロチオネインという重金属と特異的に結合するタンパク質を発現し、重金属を吸着，無毒化する機構が存在するともいわれている。(→Fig.3)
Fig.2 重金属イオンが酵素タンパク質を失活させる様子
Fig.3 微生物の重金属イオン耐性機構
１−５ 微生物の膜輸送のエネルギー消費と重金属イオン
一般的に、細胞膜(脂質二重層)は、O2，CO2のような非極性分子を通過させやすく、グルコースのような大型の極性分子を通しにくい。特に、金属イオンのような電荷を持つ分子は通過しない。しかし、細胞膜には有用金属用の吸収機構(膜輸送タンパク)が存在する。しかし、金属陽イオンを完全には識別できないので、吸収機構が誤って有害重金属イオンを吸収することがある。例えば、Cｄ2+のイオン半径はCa2+のそれに近く、カルシウム吸収機構によってカドミウムが吸収されることがある。また、有機金属化合物は非極性分子であるので、細胞膜を通過しやすい。
こうして、細胞内に侵入した重金属イオンは毒物として認識され、今度は能動輸送(イオンポンプ)により排出される。
また、細胞膜が能動輸送により、金属イオンやグルコースなどの取り込み，排出を行うとき、ATPエネルギーが消費される。好気性微生物の場合、それとともに、ATPの合成が開始される。ATP合成に消費されるエネルギーは、呼吸基質の異化の最終段階基質(NADH)の酸化的リン酸化によるものがほとんどである。よって、能動輸送が働くとき、それと連動して酸素が消費されるといえる。
